今天小編給大家講解一下細(xì)胞傳代培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)過程:
首先將新鮮培養(yǎng)基置于37℃電熱恒溫水浴鍋中回溫,回溫后噴以75%酒精并擦拭之,移入無菌操作臺內(nèi)。如配置:50mL*培養(yǎng)基(含10%FBS,1%青鏈霉素雙抗)44.5mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 5mL FBS + 0.5mL青鏈霉素雙抗。戴防護(hù)手套后,自液氮罐中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊,立即放入37℃水槽中快速解凍(避免冰晶重新結(jié)晶而造成細(xì)胞死亡),輕搖冷凍管使其在2分鐘內(nèi)全部融化,以75%酒精擦拭保存管外部,移入無菌操作臺內(nèi)。
然后將解凍的1mL細(xì)胞懸液緩緩加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi),再向瓶中加入10mL*培養(yǎng)基(稀釋比例為1:10),混合均勻,放入37℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取0.1ml解凍細(xì)胞懸液作存活測試。(Sf9細(xì)胞在27℃生長,可不需CO2) 。 一般而言,細(xì)胞大都不需立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO)。若要立即去除,則將解凍的細(xì)胞懸液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi),離心1300rpm,5分鐘,移去上清液,加入新鮮培養(yǎng)基,混合均勻,放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。若不需立即去除冷凍保存劑,則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。
37℃恒溫培養(yǎng)約48小時(shí),待細(xì)胞長滿80-90%后,從培養(yǎng)箱取出75cm2培養(yǎng)瓶,倒掉培養(yǎng)基。加入5mLPBS緩沖液吹打以洗去殘留血清,倒掉緩沖液。沿壁(無細(xì)胞的一面)緩緩加入1mL胰酶溶液消化細(xì)胞約1min,輕輕搖晃,倒掉殘余胰酶,將培養(yǎng)瓶置于恒溫箱中約1min,拿出培養(yǎng)瓶輕輕拍打一下細(xì)胞貼壁的一面。
注意:消化溫度是37℃,加液后用移液管反復(fù)吹打分散細(xì)胞。
向瓶中加入5mL*培養(yǎng)基,反復(fù)吹打均勻2min,從中取出20μl至0.5ml小離心管中,向管中加入80μl臺盼藍(lán)溶液,混勻,從混合液中取出10μl至蓋好蓋玻片的計(jì)數(shù)板上,計(jì)算細(xì)胞密度及活率。將5mL細(xì)胞懸液全部吸出,分別接種1mL懸液到原培養(yǎng)瓶和另一新的培養(yǎng)瓶中,其余舍棄。再向兩瓶中各加入10mL*培養(yǎng)基,置于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(細(xì)胞傳代時(shí)按1:5或更大比例稀釋)
細(xì)胞凍存:
1. 冷凍前確保細(xì)胞處于指數(shù)生長期,傳代后的5mL細(xì)胞懸液取出1mL接種到培養(yǎng)瓶繼續(xù)傳代。另取一無菌離心管,將剩余4mL細(xì)胞懸液置于其中,離心1000rpm,5min(轉(zhuǎn)速勿超過1500rpm)。
2. 離心后倒掉上層清液,收集下層細(xì)胞沉淀。向離心管中加入900ul*培養(yǎng)基,用槍頭反復(fù)吹打重懸起細(xì)胞。取少量細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。一般細(xì)胞濃度為2~5×106cells/ml較適宜。
3. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入1.5mL無菌凍存管中,再加入100ul試劑級DMSO,混勻,制成細(xì)胞凍存懸液(DMSO后濃度為10%)。嚴(yán)密封口后,注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期,然后進(jìn)行凍存。
注意:對Sf9細(xì)胞而言,凍存比例為:95%培養(yǎng)液+5%DMSO。
4. 傳統(tǒng)方法:冷存管置于4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16~18小時(shí)(隔夜)→液氮罐長期儲存。(-20℃勿超過1小時(shí),防止胞內(nèi)冰晶過大造成細(xì)胞死亡)
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